黄连碱对骨肉瘤细胞生长和血管生成拟态的选择性抑制作用及其机理

【摘要】目的：探讨黄连碱（Coptisine,COP）对人骨肉瘤细胞MG63细胞生长和血管生成拟态的作用，并研究其作用机制。方法：采用AlamarBlue方法检测黄连碱对人骨肉瘤细胞MG63增殖的作用；用TUNEL染色方法观察COP对MG63细胞凋亡的影响；运用小鼠移植瘤模型观察COP对小鼠MG63移植瘤的作用以及毒副作用的影响；PI染色法观察COP对MG63细胞周期的影响；Westernblot法检测COP对MG63细胞周期相关蛋白和信号通路相关蛋白的影响；采用Matrigel细胞类血管生成模型观察COP对MG63细胞和正常血管内皮细胞HLVEMC体外类血管生成的影响；采用细胞划痕实验观察COP对MG63细胞迁移能力的影响；采用细胞粘附实验检测COP对MG63细胞粘附作用的影响；采用transwell小室检测COP对MG63细胞侵润能力的影响；采用半定量RT-PCR和Westernblot方法检测COP对MG63血管生成拟态相关基因和蛋白的作用；采用化学发光实验检测COP对VE-cadherin启动子活性的影响。结果：AlamarBlue实验结果显示，COP对人骨肉瘤细胞MG63表现出较好的增殖抑制作用，且48h和72h的半数抑制浓度分别为12.99μM和9.38μM；小鼠移植瘤模型实验结果表明，COP可有效抑制骨肉瘤MG63移植瘤的生长；PI单染和Westernblot结果显示，COP可将MG63细胞周期阻滞在G0/G1期，并且细胞周期相关蛋白细胞周期依赖性激酶4（CDK4）和细胞周期蛋白D1（cyclinD1）的表达受到明显的抑制；信号通路实验结果显示，COP显著减少了STAT3蛋白的磷酸化表达。另外，COP可有效地抑制人骨肉瘤细胞MG63血管形成、细胞粘附、细胞迁移和细胞侵袭并呈剂量依赖性，但对正常内皮细胞HLMVEC体外类血管生成无明显的抑制作用；半定量RT-PCR实验结果显示，COP能明显抑制MG63血管生成拟态相关基因钙黏连蛋白（VE–cadherin）和整合素β3（Integrinβ3）的表达，Westernblot结果亦显示，COP可明显抑制VE–cadherin蛋白的表达；化学发光实验结果表明，COP可有效抑制VE–cadherin启动子的活性，并呈剂量依赖性。此外，COP对人外周血细胞和人肺微血管内皮细胞的增殖无明显的抑制作用，并且对小鼠体重和血液学指标影响不大，说明COP对体内外细胞毒副作用很小，并具有一定的选择性。结论：1.COP能有效抑制人骨肉瘤细胞MG63细胞增殖但对人正常外周血细胞和肺微血管内皮细胞无明显作用，其作用机制可能与下调细胞周期相关蛋白CDK4和cyclinD1的表达将细胞周期阻滞在G0/G1期以及降低信号通路蛋白STAT3的磷酸化水平有关。2.COP能抑制MG63细胞迁移、粘附、侵袭以及血管生成，其作用机制可能与VE–cadherin、Integrinβ3表达水平的降低和抑制骨肉瘤细胞内VE–cadherin启动子的活性有关。3.COP对正常细胞体外增殖和正常内皮细胞类血管生成无明显影响，且对裸鼠体重和血液学指标也无明显影响，提示COP毒副作用很小，具有一定的安全性，有可能作为抗骨肉瘤新药的候选先导化合物。
【作者】虞迪；
【导师】周泉生；
【作者基本信息】苏州大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】黄连碱；骨肉瘤；癌症；细胞增殖；血管新生；血管生成拟态；

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